STUDIO DELLA NEUROFASCINA NEGLI ORGANOIDI CEREBRALI:
Dalla fisiologia del neurosviluppo alla patogenesi della nodopatia ereditaria da mutazione della Neurofascina
Gloria e Samuel
Gloria e Samuel, sorella e fratello, sono due giovani pazienti affetti da una malattia genetica ultrarara. Presentano un quadro neurologico caratterizzato da atassia cerebellare e neuropatia ad esordio infantile. Nel corso degli anni sono state eseguite diverse analisi genetiche che hanno escluso numerose cause note di atassia cerebellare ma che non hanno permesso di porre una diagnosi genetica certa. È stata quindi eseguita un’analisi genetica innovativa (whole-exome sequencing) che ha permesso di studiare tutti i geni di Gloria e Samuel contemporaneamente. Questo studio ha permesso l’identificazione di una mutazione genetica omozigote a carico del gene che codifica per la proteina Neurofascina. Questo gene non era mai stato associato ad una malattia genetica umana fino a quel momento. La mutazione è localizzata nell’unico dominio transmembrana della proteina e determina una ridotta stabilità della stessa nella membrana. Studi funzionali sulle cellule di Gloria e Samuel (neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti) hanno confermato un effetto deleterio della mutazione sulla quantità e sulla localizzazione della Neurofascina. Nei mesi successivi alla pubblicazione di questa scoperta, sono stati descritti in letteratura altri sei casi di atassia cerebellare associata a mutazioni recessive del gene Neurofascina.
Scopo del progetto
Lo scopo del progetto è quello di studiare la funzione della proteina Neurofascina negli organoidi cerebrali ed il meccanismo del danno dovuto a mutazioni della stessa, confrontando con varie metodiche organoidi cerebrali derivati dalle cellule di Gloria e Samuel con quelli di controlli sani.
La Neurofascina
La Neurofascina è una proteina fondamentale per il normale sviluppo ed il corretto funzionamento del sistema nervoso, sia centrale (encefalo) che periferico (nervi). Dal punto di vista microstrutturale è una proteina transmembrana di grandi dimensioni con un unico dominio transmembrana, un dominio intracellulare ed un dominio extracellulare.
La sua funzione sembra sia principalmente di natura “portante”, infatti permette il collegamento strutturale tra i neuroni e le cellule gliali. In particolare, nel sistema nervoso centrale la Neurofascina unisce i neuroni e gli oligodendrociti, mentre nel sistema nervoso periferico congiunge i neuroni e le cellule di Schwann. Gli oligodendrociti e le cellule di Schwann permettono la mielinizzazione e quindi l’isolamento elettrico dei tronchi nervosi. Più precisamente, la Neurofascina si localizza a livello dei nodi di Ranvier, che sono quelle strutture fondamentali costituite da neuroni e cellule gliali che permettono la conduzione nervosa saltatoria lungo la fibra nervosa. La Neurofascina permette la corretta organizzazione strutturale ed il giusto funzionamento del nodo di Ranvier. Infine, la Neurofascina sembra avere un ruolo fondamentale anche nello sviluppo del sistema nervoso centrale, in particolare delle cellule del Purkinje, i neuroni principali del cervelletto.
La Neurofascina nell’adulto è presente in due isoforme principali, codificate dal medesimo gene (NFASC). Una isoforma è neuronale, detta Nfasc186, mentre l’altra, più corta, è gliale, detta Nfasc155. Tuttavia, sono note diverse altre isoforme più rare, la cui funzione non è ancora del tutto nota. Si pensa che alcune di queste isoforme vengano espresse nel periodo embrionale e siano necessarie per un corretto neurosviluppo.
I modelli in vitro e gli organoidi cerebrali
La scoperta delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) ha determinato un forte impulso alla capacità di creare modelli in vitro di numerose malattie genetiche. La possibilità di differenziare le iPS in neuroni permette di studiare in particolare le malattie neurogenetiche.
Partendo dalle cellule della cute di Gloria e Samuel sono stati generati dei neuroni in vitro. Questo processo ha permesso di dimostrare in modo inequivocabile che la mutazione identificata della Neurofascina causava un effetto deleterio ed era quindi patogenica. Questo modello, tuttavia, è troppo riduttivo per riprodurre la normale funzione della Neurofascina in vivo. Infatti, la Neurofascina svolge proprio la sua funzione nella interrelazione tra neuroni e glia e non si limita quindi alla sola popolazione neuronale. Riteniamo quindi che per studiare più nel dettaglio la funzione della Neurofascina in vitro sia necessario un modello più avanzato. Un avvenieristico approccio è quello della generazione di organoidi cerebrali a partire da iPS, che sono strutture tridimensionali coltivate in vitro che contengono la maggior parte delle componenti cellulari del tessuto nervoso normale, inclusi neuroni e cellule gliali.
Piano di lavoro
1) Generazione di iPS a partire da fibroblasti cutanei di Gloria, Samuel e due controlli sani. Caratterizzazione delle iPS per accertarne la staminalità e l’assenza di eventuali aberrazioni cromosomiche indotte dalla riprogrammazione. Generazione di organoidi cerebrali a partire dalle iPS generate.
2) Studi di microscopia elettronica a diversi momenti dello sviluppo degli organoidi cerebrali, confrontando i risultati di Gloria e Samuel con quelli dei due controlli, per osservare e descrivere eventuali alterazioni strutturali nei pazienti ed eventuali modifiche nel corso dello sviluppo.
3) Studi di immunoistochimica ed immunofluorescenza a diversi momenti dello sviluppo degli organoidi cerebrali, confrontando i risultati di Gloria e Samuel con quelli dei due controlli, per osservare eventuali modifiche della localizzazione proteica nei pazienti ed eventuali cambiamenti nel corso dello sviluppo.
4) Studi di immunoblot a diversi momenti dello sviluppo degli organoidi cerebrali, confrontando i risultati di Gloria e Samuel con quelli dei due controlli, per osservare alterazioni della quantità di proteine rilevanti del nodo di Ranvier ed eventuali modifiche nel corso dello sviluppo.
Finanziamento del progetto
Questo progetto è finanziato dalle numerose iniziative di raccolta fondi fortemente volute dai genitori di Gloria e Samuel con il generoso supporto della loro comunità. Lo scopo del finanziamento è quello di supportare la ricerca sulla comprensione dei meccanismi patologici alla base di questa forma genetica rara, nella prospettiva di identificare possibili approcci terapeutici in futuro.
