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L’attività di ricerca del laboratorio è volta alla comprensione dei fattori che influiscono sulla proliferazione e sul differenziamento delle cellule staminali, per valutarne le potenzialità terapeutiche nel trattamento delle distrofie muscolari e delle malattie neurodegenerative.
Le Distrofia muscolare di Duchenne (DMD)
 La distrofia muscolare di Duchenne, malattia monogenica legata al cromosoma X che colpisce un nuovo nato maschio ogni 3.500, è caratterizzata da una mutazione del gene che codifica per la distrofina . Questa mutazione causa un’alterata funzione , a livello della membrana muscolare, del complesso formato dalla distrofina e dalle glicoproteine ad essa associate determinando una perdita della funzione cellulare e una sostituzione del tessuto muscolare con tessuto fibro-adiposo. A tutt’oggi le prospettive terapeutiche sono limitate. L’evidenza che le cellule staminali isolate dal muscolo, trapiantate in un topo con una distrofinopatia congenita, ripristinassero parzialmente la normale produzione di distrofina nel muscolo striato e nel cuore durante la vita postnatale, ha spronato la comunità scientifica ad approfondire la ricerca su questo senso. In questi anni il lavoro del nostro gruppo si è concentrato sulla caratterizzazione delle potenzialità miogeniche di diverse popolazioni cellulari isolate da tessuto muscolare e da sangue periferico umano; in particolare abbiamo focalizzato l’attenzione sulla frazione cellulare esprimente l’antigene di membrana CD133, marker tipicamente espresso dalle cellule staminali ematopoietiche e/o da progenitori endoteliali. La valutazione delle potenzialità miogeniche di queste cellule è stata condotta con approcci sperimentali sia in vitro che in vivo, utilizzando un modello murino di distrofia muscolare immunodepresso, il topo scid/mdx.
Alcuni nostri recenti evidenziano la capacità delle cellule staminali di riparare danni muscolari e di ricostituire, in seguito ad una iniezione intra-arteria, il pool di cellule satelliti presenti nel muscolo.
In tal senso, per valutare la capacità migratoria delle cellule staminali circolanti CD133+ si è analizzata al citofluorimetro l’espressione di molecole di adesione e recettori di chemochine sulla loro superficie. In questa fase dello studio le CD133+ sono apparse co-esprimere integrine espresse da cellule eosinofile e basofile, e inoltre più del 50% delle cellule staminali circolanti esprimono molecole d’adesione coinvolte nella migrazione dei linfociti attraverso il rolling e l’homing dei linfociti T. Generalmente nei leucociti l’espressione dei recettori delle chemochine e delle molecole di adesione è regolato dall’ambiente infiammatorio, mentre le cellule CD133 positive ottenute dal sangue non sembrano essere influenzate in maniera significativa da queste condizioni. Le cellule circolanti CD133+ esprimono un completo pattern di molecole di adesione e di recettori di chemochine responsabili della loro capacità di migrare attraverso i vasi anche in condizioni basali, non necessitando di alcuno stimolo di attivazione.
Con l’utilizzo della microscopia intravitale sono stati analizzati anche i vasi del topo scid/mdx per l’espessione dei controligandi delle molecole di adesione. I risultati mostrano come l’espressione di molecole d’adesione, in particolare VCAM, sull’endotelio di un muscolo distrofico rappresenti un meccanismo chiave per la capacità di migrare delle cellule CD133+ e accrescono in modo significativo le potenzialità di una terapia per la distrofia muscolare che si basi sulla somministrazione di cellule staminali attraverso il distretto arterioso.
In un lavoro, svolto in collaborazione con il Dipartimento di Scienze Applicate, Politecnico Università delle Marche, le cellule CD133+ sono state marcate con nano-particelle di ossido di ferro, utilizzando l’ENDOREM, un tracciante vitale ed inerte, già usato in clinica. In questo studio è stato dimostrato come la microtomografia a raggi x sia in grado di visualizzare ad alta definizione e risoluzione cellule staminali umane così marcate e trapiantate intra-arteria in un topo scid-mdx. Questa tecnica offre inoltre la possibilità di ottenere una quantificazione del numero di cellule che sono in grado di migrare dal torrente circolatorio all’interno del tessuto muscolare ed inoltre permette la visualizzazione tridimensionale della loro distribuzione nel tessuto ricevente. La marcatura con Endorem è un approccio promettente per poter visualizzare le cellule staminali in vivo e potrebbe essere un aiuto significativo per capire i processi di base che regolano il loro homing e le loro capacità migratorie.
In collaborazione con il gruppo di ricerca diretto dal Professor Cossu presso l’Ospedale San Raffaele di Milano abbiamo indagato il potenziale migratorio dei mesangioblasti, una popolazione di cellule staminali associate ai vasi sanguigni in grado di differenziare in diversi tipi cellulari di derivazione mesodermica, tra cui anche il muscolo. Una delle ragioni dell’effetto soltanto parziale dei mesangioblasti in questo modello di distrofia potrebbe essere la loro limitata capacità di raggiungere e colonizzare il muscolo, capacità questa che dipende a sua volta da una incompleta adesione all’endotelio. Quindi per incrementare l’efficienza di riparare il danno muscolare utilizzando i mesangioblasti diventa essenziale riuscire ad aumentare la loro potenzialità migratoria nel distretto muscolare. In un recente lavoro si è infatti dimostrato che i mesangioblasti se esposti a diverse citochine, tra cui le più importanti sono SDF 1 e TNF a, acquistano la capacità di migrare in vitro e in vivo dopo trapianto intra-muscolo in modelli murini distrofici. In questi studi si è osservato che anche la transiente espressione di a4 integrina o L-selectina aumenta in modo significativo (di cinque volte) le capacità migratorie di queste cellule sia in vitro che nel muscolo distrofico con la conseguente produzione di nuove fibre che esprimono la normale copia del gene mutato. Negli ultimi anni alcune ricerche scientifiche hanno dimostrato che il solo modello animale che riproduce in modo specifico le alterazioni del gene della distrofina e tutto il decorso della patologia umana è il modello canino golden retriver. Questi animali malati presentano una singola mutazione a livello dell’esone 6, che porta alla completa assenza della proteina distrofina e ad una forma severa di distrofia, che compromette tutti i muscoli tra cui quelli del tratto faringeo, i polmoni, il cuore. La degenerazione progressiva della muscolatura scheletrica e cardiaca porta questi animali alla morte nel primo anno di vita. Per testare l’efficacia di una terapia genica e/o cellulare abbiamo condotto un altro studio in collaborazione con il Professor Cossu . In questa ricerca si è dimostrato che dal trapianto di mesangioblasti in cani distrofici è possibile ottenere una estesa ricostruzione di fibre esprimenti la distrofina ed un incremento della forza di contrazione, nonché, in molti casi, preservarne la capacità di camminare. L’analisi di questi risultati potrebbe portare ad un futuro clinical trial che preveda l’utilizzo di cellule staminali prelevate da un donatore isto-compatibile, sotto regime di immunosoppressione.
Nel nostro laboratorio abbiamo inoltre sviluppato una considerevole esperienza riguardo alle caratteristiche biologiche delle cellule staminali somatiche adulte nell’ambito di diversi progetti di ricerca riguardanti l’uso di cellule staminali nelle patologie muscolari.
E’ interessante notare che le cellule staminali derivate da muscolo, trapiantate in un topo con una distrofinopatia congenita, ripristinano parzialmente la normale produzione di distrofina nel muscolo striato e nel cuore durante la vita postnatale. E’ stato inoltre dimostrato che progenitori muscolari come i mioblasti si possono fondere con le cellule dell’ospite dopo trapianto in un tessuto danneggiato o malato nel quale le cellule dell’ospite vadano incontro a rigenerazione (ad esempio nel tessuto distrofico). Sebbene il trapianto di mioblasti normali in un topo distrofina-deficiente sia in grado di ripristinare l’espressione della distrofina, l’identificazione di una popolazione staminale meno commissionata e il suo utilizzo in campo clinico potrebbe migliorare questo tipo di approccio terapeutico. Per questo motivo abbiamo condotto uno studio clinico di Fase I per dimostrare la non tossicità delle cellule staminali CD133+ trapiantate in muscoli di bambini affetti da distrofia muscolare di Duchenne. Abbiamo osservato in seguito al trapianto autologo di cellule staminali AC133+ di derivazione muscolare in 5 soggetti DMD che il trapianto intramuscolare di cellule staminali AC133+ derivate da muscolo nei pazienti DMD è una procedura sicura. Infatti abbiamo trovato un profilo di sicurezza eccellente per le cellule staminali AC133+ in tutti i pazienti sottoposti al trapianto. Le cellule staminali iniettate possono essere incorporate in vasi nascenti e miofibre creando un microambiente proangiogenico/miogenico attraverso il rilascio di citochine e fattori di crescita. Inoltre, una volta iniettate nel muscolo adduttore breve del mignolo i progenitori AC133 positivi possono reclutare altri progenitori miogenici come mesangioblasti endogeni attraverso la secrezione di fattori di crescita. Questi dati sorpassano ogni aspettativa, specialmente pensando che le cellule staminali iniettate non producono la proteina distrofina.
Proprio per questo motivo abbiamo cercato di estendere queste osservazioni per tentare di indurre la riespressione di distrofina nelle cellule staminali AC133+. Nell’ottica di un eventuale proseguimento clinico della fase I del trapianto autologo si cellule staminali in soggetti DMD abbiamo iniziato ad investigare la possibilità di combinare la terapia cellulare e la tecnica di exon skipping.
L’approccio dell’exon-skipping è stato sviluppato per ricostituire un quadro di lettura corretto al momento della trascrizione del gene codificante per una proteina distrofina funzionale. In effetti, numerose delezioni, che possono concernere uno o più esoni, sono in grado di essere riportate ad un corretto quadro di lettura in seguito alla soppressione di uno o di diversi altri esoni contenuti nella regione di interesse.Questi meccanismi di skipping occasionalmente si presentano spontaneamente e sono responsabili della comparsa di fibre distrofino positive dette “revertant”, osservate mediante saggi di immunoistochimica su sezioni di muscoli mdx. Abbiamo scelto la delezione ?49-50 per testare la capacità dell’exon-skipping di rendere in frame la sequenza dell’mRNA della distrofina di cellule staminali AC133+. Per raggiungere questo scopo sono state utilizzate sequenze oligoribonucleotidiche antisenso poste tra l’introne 48 e l’esone 51 e tra l’introne 51 e l’esone 52, le quali mascheravano in modo specifico il sito contenente il codone di stop prematuro permettendo la progressione della lettura degli altri esoni del gene della distrofina.
Le cellule staminali ?49-50 skippate sono state in grado di fondersi in vivo con fibre in rigenerazione e si dimostrano capaci non solo di portare all’espressione di una distrofina umana funzionale, ma anche di ripristinare il complesso associato alla distrofina, come ? e ?-sarcoglicani .
La macchina di lettura è quindi “forzata” ad eseguire una lettura alternativa più larga. Questi oligoribonucleotidi modificati (chiamati 2’-O-metil oligoribonucleotidi) sono stati inizialmente impiegati con un certo successo nei mioblasti di topo mdx, in seguito per trasfezione intramuscolare nei topi mdx utilizzando dei complessi liposomali o della lipofectina. Recentemente l’efficienza di exon-skipping è stata aumentata grazie all’accoppiamento degli oligoribonucleotidi con un piccolo snRNA, l’ U7snRNA. In prospettiva clinica, la tecnica dell’exon-skipping deve poter interessare un vasto territorio muscolare per avere una realtà terapeutica. Le iniezioni intramuscolari danno conferma della bontà del metodo di approccio, ma gli effetti restano troppo limitati al territorio muscolare trattato. L’inserimento di sequenze antisenso in vettori virali aventi un forte tropismo muscolare permette un avanzamento importante in termini di diffusione del trattamento. In effetti, l’approccio della terapia genica ha condotto alla costruzione ed all’iniezione di vettori AAV (Virus Adeno-Associated) per via sistemica (intravenosa ed intra-arteriosa) nei topi mdx (Goyenvalle A et al, 2004). Gli spettacolari risultati della re-espressione di una distrofina funzionale in un vasto territorio muscolare, con il recupero di forza specifica, hanno portato il gruppo di Luis Garcia dell’istituto Genethon ad applicare questo approccio nel modello canino di distrofia muscolare. Risultati preliminari condotti da questo gruppo dimostrano che l’iniezione nell’ arteria femorale di AAV veicolanti U7snRNA porta alla produzione di più di 2000 fibre distrofino positive per sezione di muscolo. Purtroppo l’approccio mediante AAV pone il problema della risposta immunitaria, che viene tanto più evidenziato nel caso di iniezioni ripetute del vettore. A questo punto si può ipotizzare di ristabilire il quadro di lettura del gene della distrofina mediante exon-skipping in cellule staminali isolate dal sangue o dal muscolo. Quindi la combinazione di trattamento cellulare e genico porterebbe alla correzione ex vivo di cellule umane malate ed alla riespressione della distrofina in vivo dopo il loro trapianto. Abbiamo quindi iniziato a lavorare in questa direzione collaborando direttamente con il gruppo di Luis Garcia. In questi esperimenti, grazie all’utilizzo di vettori lentivirali abbiamo ottenuto l’espressione della distrofina in cellule staminali CD133 positive isolate dal sangue di soggetti con delezione 48-50 e 49-50. Queste cellule sono state poi iniettate direttamente nei muscoli di topi distrofici ed immunodepressi scid/mdx. Dopo 2 mesi dal trapianto intramuscolare nel muscolo dei topi scid/mdxerano presenti fibre distrofino positive. Ora stiamo cercando di ottenere i medesimi risultati con cellule isolate da soggetti con altri tipi di delezioni quali ad es. quelle degli esoni 50 e 52. Questi dati devono considerarsi preliminari e bisognosi di ulteriori conferme prima di poter pensare a future applicazioni cliniche.
Le malattie neurodegenerative
 I progenitori neuronali capaci di dare vita a cellule neuronali e gliali sono stati isolati dal tessuto cerebrale embrionale. Queste cellule sono anche ritrovabili in minor quantità in alcune aree cerebrali (periventricolari e del bulbo olfattorio) di cervelli adulti. Questi progenitori neuronali sono in grado di proliferare in vitro in presenza di alcuni fattori di crescita dando vita ad un pool di cellule sempre disponibile per eventuali trapianti.
I gliomi costituiscono un gruppo di tumori che, nonostante i progressi diagnostici e terapeutici, continuano ad avere prognosi infausta soprattutto a causa dell’elevata eterogeneità del tumore stesso che costituisce la difficoltà principale nella classificazione e nella gestione clinica.
Per questa ragione negli ultimi anni si è sviluppata una ricerca mirata all’identificazione delle alterazioni genetiche espresse dai glomi nel tentativo di meglio definire eventuali target terapeutici che consentano una maggior efficacia dei trattamenti. In questo ambito diverse sono le tipologie di anomalie genetiche all’interno di tumori alla stessa stadiazione clinica così come associazioni tra alcune di esse che consentono di definire il grado di progressione tumorale.
Gli astrocitomi di basso grado sono caratterizzati da delezioni del cromosoma 17 e mutazioni del gene p53 che risiede nella regione deleta. Poiché p53 codifica per una proteina regolatrice del ciclo cellulare, la sua mutazione causa una replicazione incontrollata delle cellule con conseguente accumulo di ulteriori mutazioni. Sebbene questo tipo di mutazione sia presente nel 65% degli astrocitomi di basso grado, si riscontra anche in pazienti con astrocitomi anaplastici e GBM, suggerendo la possibilità che questi ultimi siano l’esito di una progressione da un basso grado.
Lo stadio successivo, l’astrocitoma anaplastico, presenta per la maggior parte alterazioni di geni coinvolti nella regolazione del ciclo cellulare. Le più frequenti coinvolgono il gene Rb, presente nel 40% dei pazienti, e le proteine di controllo del ciclo cellulare ad essa associate quali CDK4 e INK4A. L’amplificazione del gene di EGFR ricorre nel 40-50% dei gliomi ad alto grado mentre in gliomi di grado minore spesso la sua mutazione promuove la progressione a GBM; il recettore mutato non può legarsi al ligando, ma è costitutivamente attivato e promuove la proliferazione cellulare, la migrazione e l’invasione. Sembra inoltre che la mutazione nell’espressione di EGFR sia la causa della resistenza alla radio e/o chemio-terapia di alcuni GBM. Un’altra importante alterazione genetica molto frequente nei GBM coinvolge il gene oncosoppressore che codifica per una fosfatasi che antagonizza la funzione della PI3K. La sua mutazione porta ad un’attivazione costitutiva della PI3K che esita in una disregolazione del ciclo cellulare e della sopravvivenza cellulare. MGMT, infine, è una proteina riparativa che rimuove i gruppi alchilici dal DNA e, riducendo la citotossicità indotta dai chemioterapici alchilanti, è implicata nella resistenza tumorale alla terapia. La conversione G:C->A:T nell’isola CpG e la metilazione del promotore di questo gene causano nei GBM la perdita d’espressione della proteina e quindi una maggior risposta alla terapia .
 Dati recenti hanno inoltre evidenziato la presenza di cellule staminali nei tumori di origine gliale (1,2,3). In questi studi si è evidenziata la capacità oncogenica da parte di cellule staminali isolate da glioblastoma esprimenti vari markers quali il CD133 ed il Thy1. Infatti, l’iniezione di queste cellule in topi immunodeficienti ha determinato la formazione di un nuovo tumore gliale di medesima caratteristica istologica. Inoltre, le cellule isolate dai tumori gliali mantengono potenzialità staminali in senso neurale come dimostrato da esperimenti basati sull’espansione clonale e sul differenziamento della progenie nei tre lineage neurali (astrociti, neuroni e oligodendrociti).
Non si è ancora chiarito il ruolo effettivo che queste cellule ricoprono nell’oncogenesi. Nel caso in cui sia la componente staminale del tumore a presentare alterazioni genomiche o cromosomiche di per se, si può ipotizzare che siano esse la causa dell’insorgenza tumorale in seguito a meccanismi che ne inducono la disregolazione nella crescita. In alternativa potrebbe essere il tumore ad esercitare influenze metaboliche su queste cellule inducendole a modificazioni in senso neoplastico che persistono anche in seguito all’impianto della cellula in un ambiente sano.Questo suggerisce che anche i gliomi potrebbero trovare origine nella proliferazione di cellule staminali neurali che si verrebbero a delineare come un nuovo e più efficace target terapeutico.
La scoperta dell’esistenza di queste cellule ha spostato quindi l’attenzione della ricerca verso una più approfondita analisi del loro comportamento molecolare e genetico, finalizzata alla comprensione delle caratteristiche che causano il mantenimento del clone tumorale e la progressione del tumore stesso.
Nel nostro laboratorio abbiamo isolato cellule staminali e progenitori da biopsie di gliomi al fine di ottenere neurosfere formate da cellule CD133+. Infatti non si è ancora in grado di determinare quali siano le cellule capaci di sostenere la crescita del tumore tra tutte quelle, morfologicamente diverse, presenti nella massa tumorale. Oltre all’analisi genetica, abbiamo valutato le capacità di rigenerazione, di differenziazione nei tre lineage neurali e l’eventuale insorgenza di nuove alterazioni genomiche sia in vitro che in vivo, dopo l’impianto delle cellule in topi nude. Da questo studio si vuole ottenere un’analisi dettagliata del pattern genetico di cellule CD133+ isolate da campioni bioptici di gliomi di diverso grado e seguite dopo l’espianto sia in vivo che in vitro al fine di chiarire quale ruolo rivestano nell’insorgenza e nel mantenimento del tumore. Studi morfologici hanno consentito una conoscenza soltanto parziale del comportamento clinico dei tumori gliali; fenotipi simili, infatti possono avere differenti prognosi e differenti risposte ai trattamenti.
L’instabilità e l’eterogeneità genomica del tumore in toto rendono infatti difficile la sua analisi più fine negli aspetti molecolari e genetici mentre può risultare più semplice lo studio genetico delle neurosfere da esso originate tra le quali si potrebbe discriminare più facilmente aberrazioni patogenetiche. Verificare se queste cellule possano essere la causa dell’insorgenza dei gliomi costituisce un punto di partenza importante per approfondire la comprensione dei meccanismi che sottostanno all’enorme eterogeneità genetica, e di conseguenza ad un’estrema complessità fenotipica, osservata in questi tumori. L’identificazione di cellule che ricoprono un ruolo chiave all’interno della popolazione tumorale e la loro caratterizzazione genomica ci possono consentire di definire con più precisione le caratteristiche del singolo caso e di prevedere il comportamento clinico del tumore.
Inoltre l’analisi può far emergere il ruolo di diversi fattori cellulari coinvolti nella crescita tumorale che si possono candidare come potenziali nuovi target terapeutici più specifici e più efficaci.
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