Encefalopatie mitocondriali

Negli ultimi due decenni, un numero sempre maggiore di malattie neurologiche è stato attribuito a disfunzioni della catena respiratoria mitocondriale. I mitocondri sono gli organelli intracellulari che generano ATP e contengono un proprio genoma (mtDNA), ereditato in via matrilineare. La generazione di ATP tramite la fosforilazione ossidativa utilizza cinque complessi enzimatici, le cui subunità sono codificate sia dal DNA nucleare (nDNA) che dal mtDNA. Questo doppio controllo genetico spiega le possibile eredità mendeliana o matrilineare dei disordini mitocondriali. Un dato caratteristico delle patologie da DNA mitocondriale è costituito dalla contemporanea presenza nello stesso tessuto di molecole normali e molecole mutate (eteroplasmia). L'espressione fenotipica di una mutazione dipende dalla quantità di mtDNA mutato e dalla soglia tissutale. I tessuti ad alta richiesta energetica, muscolo scheletrico, miocardio e sistema nervoso, risentono maggiormente di disfunzioni mitocondriali, che possono tuttavia virtualmente interessare ogni tessuto.

La diagnosi su basi cliniche e di laboratorio di malattia mitocondriale richiede una definitiva conferma dalla dimostrazione di un difetto molecolare specifico, che consente di valutare le modalità di trasmissione e di fornire una consulenza genetica. Un numero molto elevato di mutazioni del mtDNA (delezioni singole e multiple, oltre 70 mutazioni di tRNA e geni strutturali) sono state associate con quadri clinici specifici. Il ruolo dei geni nucleari nella eziopatogenesi delle mitocondriopatie è ancora in fase di definizione e comprende geni responsabili di aspetti diversi della biogenesi mitocondriale. Sono responsabili di forme a letalità precoce neonanatale infantile geni il cui prodotto proteico svolge un ruolo regolatorio nella sintesi e/o assemblaggio dei complessi della catena respiratoria mitocondriale (ad esempio, SCO1, SCO2, COX10, SURF), mentre una serie di oftalmoplegie estrinseche progressive ad eredità mendeliana dell’adulta sono causate da geni implicati nel metabolismo e/o nella stabilità del DNA mitocondriale (ANT1, C10orf2, POLG1) Infine una discreta proporzione di pazienti non rientra in categorie genetiche note.

Miopatie metaboliche

Questa area della patologia muscolare costituisce un terreno di indagine clinico-biochimica e poi molecolare dall’esordio del laboratorio di biochimica, con caratterizzazione dei difetti della via glicogeno e glicolitica (deficit dell’enzima deramificante, di maltasi acida, di miofosforilasi di fosfogliceratomutasi, di b-enolasi) e lipolitica (deficit della b-ossidazione mitocondriale, di carinitina e dell’enzima carnitina palmitoiltranferasi.
Recenti sono le caratterizzazioni molecolari del deficit di enzima deramificante e l’identificazione della Glicogenosi di tipo XIII, o deficit dell’enzima b-enolasi muscolare.

Il deficit dell’enzima amilo-1,6-glucosidasi, 4-a-glucantransferasi (AGL o enzima deramificante il glicogeno) è responsabile della Glicogenosi di tipo III (GSD III), una rara alterazione, autosomica recessiva, del metabolismo del glicogeno. Il gene AGL è localizzato sul cromosoma 1p21 ed è costituito da 35 esoni tradotti in una proteina monomerica. La malattia si presenta eterogenea dal punto di vista clinico e biochimico, il che riflette l’eterogeneità genotipo-fenotipo rilevata tra soggetti diversi; nella forma IIIa, glicogeno anomalo si accumula sia nel fegato che nel muscolo, mentre nella forma IIIb è interessato solo il fegato. Le manifestazioni cliniche della GSD III sono rappresentate da epatomegalia, ipoglicemia, iperlipidemia, bassa statura e, in numerosi casi, cardiomiopatia e miopatia. I nostri studi hanno riscontrato una eterogeneità genotipo-fenotipo della GSD III.

Il nuovo difetto enzimatico della glicolisi distale riguardante l'enolasi muscolo-specifica è stato identificato in un un paziente di 46 anni affetto da intolleranza all'esercizio, mialgie e iperCKemia episodica. Il lavoro ischemico dell'avambraccio aveva dimostrato una assenza di incremento del lattato serico. L'analisi ultrastrutturale del muscolo ha dimostrato un accumulo focale sarcoplasmatico di particelle di glicogeno. All'analisi biochimica era presente un deficit isolato di enolasi, con una attività residua pari al 5%. La proteina ß-enolasi era ridotta nel muscolo sia con metodica immunoistochimica che tramite immunoblot, mentre l'a-enolasi era normalmente espressa nello stesso tessuto. L'analisi molecolare del gene ENO3 del paziente ha dimostrato la presenza di due mutazioni missense eterozigoti a carico di residui aminoacidici altamente conservati, una transizione G467A che modifica il residuo aminoacidico Gly alla posizione 156 in Asp, e una transizione G1121A che modifica una Gly in Glut alla posizione 374. La madre era eterozigote per la mutazione G467A ed una sorella era eterozigote per la mutazione G1121A. L'enzima enolasi catalizza lo step di interconversione dell'acido 2-fosfoglicerico e dell'acido fosfoenolpiruvico, uno degli ultimi steps della via glicolitica. Il deficit di ß-enolasi si aggiunge percio' al capitolo della diagnosi differenziale delle miopatie metaboliche.

Ageing e patologie neurodegenerative

L'identificazione di un nuovo rilevante meccanismo mutazionale a carico della regione di controllo della replicazione del DNA mitocondriale alla base dell'invecchiamento cellulare potrebbe risultare fondamentale per la comprensione dell'interazione tra l'ageing e le patologie neurodegenerative nelle quali l'invecchiamento è riconosciuto come un importante fattore di rischio (Michikawa et al 1999). La regione del DLP (D-loop and adjacent transcription promoters) accumula con l'ageing specifiche mutazioni puntiformi, in particolare nella regione DLP6. Tale accumulo correla in muscoli di soggetti ultranovantenni con la presenza di fibre negative alla colorazione istochimica per l’enzima citocromo c ossidasi (Del Bo et al., 2003).

I fattori precedentemente descritti possono giocare un ruolo anche nella patogenesi del decadimento simil-Alzheimer che si osserva dopo i trent'anni nei soggetti affetti da Sindrome di Down (Del Bo et al. 2001). Uno ruolo diretto di alterazioni mitocondriali in patologie neurodegenerative è stato anche suggerito dal riscontro di una mnicrodelezione out-of-frame della Subunità I della COX in un paziente con malattia del motoneurone (Comi et al, 1998).

La sindrome di Down (DS) è la più diffusa tra le disgenesie cromosomiche. Il fenotipo caratteristico include aspetti malformativi, dismorfici, ritardo intellettivo ed ipotonia muscolare. I pazienti affetti da sindrome di Down possono essere considerati un modello potenziale per studiare lo sviluppo e le origini dei meccanismi patologici dell'Alzheimer. In entrambe le patologie rimane da chiarire in che modo e in quale proporzione il meccanismo patogenetico delle alterazioni mitocondriali possa interagire con altri elementi che caratterizzano queste patologie multifattoriali. Infatti soggetti affetti da trisomia 21 in presenza dell'aplotipo e4 del gene codificante l'apolipoproteina E presentano una maggiore rapidità di declino intellettivo, in un follow-up di oltre 10 anni, rispetto a soggetti aventi un diverso aplotipo. Inoltre l’allele Metionina 129 della proteina prionica ha un effetto additivo sulla velocità di declino cognitivo (Del Bo et al. 2003).

Terapia Genica Cellulomediata

Il trapianto di cellule staminali rappresenta una potenziale strategia terapeutica per le malattie neurodegenerative e le distrofie muscolari. Le cellule staminali somatiche dell’adulto sono presenti in diversi tessuti e sono responsabili della rigenerazione del tessuto in cui risiedono. Recenti osservazioni hanno fatto ipotizzare che alcune sottopopolazioni di cellule staminali possano "transdifferenziare" in tessuti differenti da quelli di origine. I meccanismi alla base di questo fenomeno così come l’esatta identificazione delle popolazioni cellulari coinvolte non sono ancora chiariti. Questo processo inoltre è controverso in quanto l’acquisizione di un nuovo fenotipo cellulare potrebbe essere dovuta ad una fusione cellulare.

• Studio della transdifferenziazione di cellule staminali ematopoietiche in senso miogenico nella prospettiva di una possibile terapia genica delle distrofie muscolari
  
  Nel nostro laboratorio abbiamo valutato il potenziale miogenico di cellule ematopoietiche del midollo osseo murino derivato da topi controllo, analizzando sia l’espressione di markers miogenici che l’acquisizione di un fenotipo muscolare scheletrico con la formazione di miotubi. Abbiamo osservato che, cellule esprimenti geni specifici per il muscolo striato sono presenti nel midollo osseo appena isolato e dopo coltura. E’ stata dimostrato la presenza sia di markers di programmi miogenici precoci, come Pax3, Myf5, MyoD e desmina, che di quelli miogenici tardivi, quali MyHC e a-SR-actina. Tali proteine sono state evidenziate mediante analisi immunocitochimica, Western blot e RT-PCR. Per determinare il potenziale di formazione di cloni di cellule miogeniche, le cellule sono state fatte crescere a bassa densità, isolate, e successivamente espanse. Tutti i cloni miogenici (positivi per desmina e a-SR-actina) hanno dimostrato la capacità di formare in terreno differenziativo miotubi multinucleati con alta efficienza.
  
  Per valutare il potenziale miogenico di rigenerazione tissutale delle cellule midollari, Midollo Osseo (MO) in toto e cellule miogeniche derivate da MO di topi maschi sono state trapiantate per via endovenosa in topi mdx femmine. Dodici settimane dopo il trapianto i muscoli tibiali anteriori sono stati analizzati per la determinazione dell’espressione di distrofina attraverso immunocitochimica e analisi FISH usando una sequenza cromosoma-Y-specifica per riconoscere le cellule maschili derivanti dal donatore. Una percentuale tra 0,5-2% di fibre distrofino-positive derivate dal MO del donatore sono state rilevate.
  
  
• Differenziazione neuroectodermica e microgliale di cellule staminali di derivazione ematopoietica
  
  Nel nostro studio laboratorio abbiamo valutato l’incorporazione di cellule midollari emopoietiche in diverse aree del SNC murino (cervello, midolli spinale, gangli sensitivi), dopo trapianto sistemico mediante iniezione endovenosa. Inoltre è stato valutato se l’espansione e la mobilizzazione delle cellule staminali circolanti midollari, mediante trattamento con citochine (G-CSF e SCF) producano un significativo incremento della quota di cellule neuronali di derivazione midollare a livello del parenchima cerebrale murino. Il disegno sperimentale si è basato sul trapianto intravascolare in topi di controllo adulti e neonati pre-irradiati letalmente, di midollo osseo derivato da topi maschi transgenici, esprimenti ubiquitariamente la proteina fluorescente verde (GFP) quale marker genetico di identificazione. Gli animali sono stati sacrificati a 3 mesi dal trapianto. La ricostituzione midollare è stata in media del 70%. Cellule GFP+ e Y+ sono risultate presenti in diverse aree del SNC di tutti i topi trattati (aree corticali e subcorticali, cervelletto, bulbi olfattivi). La maggior parte delle cellule GFP+ è stata riscontrata a livello dei vasi, nelle regioni pervasali e a livello leptomeningeo. Per valutare se le cellule GFP+ avessero acquisito un fenotipi neuroectodermico, abbiamo dimostrato la coespressione di markers neuronali e astrocitari mediante analisi immunocitochimica seguita da un’analisi al microscopio confocale. E’ stata inoltre osservata la presenza di cellule GFP+ esprimenti antigeni neuronali (NeuN, NF, TUJ1, MAP) sia a livello cerebrale che nel midollo spinale che nei gangli. Le piccole dimensioni di queste cellule e la mancanza di un’estesa arborizzazione dendritica fanno supporre che tali cellule presentino un fenotipo neuronale immaturo. Questi dati supportano l’ipotesi di un contributo delle cellule staminali emopoietiche alla neuroneogenesi del SNC.
  
  Cellule GFP esprimenti markers astrocitari (GFAP) sono state osservate a livello cerebrale e nel midollo spinale, ma non a livello dei gangli sensitivi. E’ stata inoltre osservata la formazione di cellule microgliali derivanti dal midollo osseo esprimenti una doppia positività per la GFP e per marker microgliali (F4/80 e Mac1). Circa il 20% di tutte le cellule GFP+ è rappresentato da cellule microgliali. Questa osservazione suggerisce che il compartimento microgliale del SNC e dei gangli sensitivi va incontro ad un turnover relativamente rapido e consistente con il contributo di cellule midollari. A livello cerebrale il numero di cellule GFP+ esprimenti antigeni neuronali (NeuN, NF, TuJ1) nel proencefalo corticale e nei bulbi olfattivi (OB) è risultato maggiore nei topi trattati con G-CSF/SCF (p<0.05, analisi di varianza, Fisher post hoc) rispetto ai controlli. Inoltre il numero di cellule GFP+ co-esprimenti marcatori neuronali è risultato più elevato negli animali trattati alla nascita che negli adulti, ed in particolare a livello dei bulbi olfattivi rispetto alle aree proencefaliche (p<0.05).
  
  I nostri risultati indicano che la somministrazione di G-CSF e SCF modula la disponibilità di cellule GFP+ nel cervello e incrementa la loro capacità di acquisire caratteristiche neuronali. Pertanto la stimolazione citochino-mediata di cellule staminali midollari autologhe costituisce una nuova ipotesi di indagine sperimentale e una possibile futura strategia terapeutica.